Организация пространства. Советы и идеи. Сад и участок
→ ↓

Проточные цитометры: анализаторы и сортеры. Проточные цитометры: анализаторы и сортеры Что «видит» цитометрия

Уникальный номер реестровой записи

Регистрационный номер медицинского изделия

ФСЗ 2007/00211

Дата государственной регистрации медицинского изделия

Наименование медицинского изделия

Реагенты для проточной цитометрии
1. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим HLA-DP, DQ, DR Antigen/FITC + к человеческим CD3/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human HLA-DP, DQ, DR Antigen/FITC + Anti-Human CD3/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 2. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD10/FITC + к человеческим CD19/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD10/FITC + Anti-Human CD19/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 3. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD2/FITC + к человеческим CD19/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD2/FITC + Anti-Human CD19/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 4. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD3/FITC + к человеческим CD19/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD3/FITC + Anti-Human CD19/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 5. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD3/FITC + к человеческим CD4/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD3/FITC + Anti-Human CD4/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 6. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD3/FITC + к человеческим CD56/RPE, 50 тестов, 1 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD3/FITC + Anti-Human CD56/RPE, 50 tests, 1 mL. 7. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD3/FITC + к человеческим CD8/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD3/FITC + Anti-Human CD8/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 8. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD4/FITC + к человеческим CD8/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD4/FITC + Anti-Human CD8/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 9. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD45/FITC + к человеческим CD14/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD45/FITC + Anti-Human CD14/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 10. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD5/FITC + к человеческим CD19/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD5/FITC + Anti-Human CD19/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 11. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим CD5/FITC + к человеческим CD20/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human CD5/FITC + Anti-Human CD20/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 12. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим Каппа Легким Цепям/FITC + к человеческим CD19/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human Kappa Light Chains/FITC + Anti-Human CD19/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 13. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим Каппа Легким Цепям/FITC + к человеческим Лямбда Легкие Цепи/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human Kappa Light Chains/FITC + Anti-Human Lambda Light Chains/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 14. Антитела двухцветные MultiMixTM к человеческим Лямбда Легким Цепям/FITC + к человеческим CD19/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Reagent, Anti-Human Lambda Light Chains/FITC + Anti-Human CD19/RPE, 50 tests, 0.5 mL. 15. Антитела двухцветные MultiMixTM контрольные, кроличьи F(ab’)2/FITC + кроличьи F(ab’)2/RPE, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Control Reagent, Rabbit F(ab’)2/FITC + Rabbit F(ab’)2/RPE, 0.5 mL. 16. Антитела двухцветные MultiMixTM контрольные, кроличьи F(ab’)2/FITC + мышиные IgG1/RPE, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Control Reagent, Rabbit F(ab’)2/FITC + Mouse IgG1/RPE, 0.5 mL. 17. Антитела двухцветные MultiMixTM контрольные, мышиные IgG1/FITC + мышиные IgG1/RPE, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Control Reagent, Mouse IgG1/FITC + Mouse IgG1/RPE, 0.5 mL. 18. Антитела двухцветные MultiMixTM контрольные, мышиные IgG1/FITC + мышиные IgG2a/RPE, 0.5 мл, MultiMixTM Dual-Colour Control Reagent, Mouse IgG1/FITC + Mouse IgG2a/RPE, 0.5 mL. 19. Антитела двухцветные MultiMixTM контрольные, мышиные IgG1/FITC + мышиные IgG2b/RPE, 1 мл, MultiMixTM Dual-Colour Control Reagent, Mouse IgG1/FITC + Mouse IgG2b/RPE, 1 mL. 20. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0101(VTEHDTLLY)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0101(VTEHDTLLY)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 21. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0101(VTEHDTLLY)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0101(VTEHDTLLY)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 22. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0101(VTEHDTLLY)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0101(VTEHDTLLY)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 23. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0101(Пептид, определяемый пользователем)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0101(Customer Defined Peptide)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 24. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0101(Пептид, определяемый пользователем)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0101(Customer Defined Peptide)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 25. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0101(Пептид, определяемый пользователем)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0101(Customer Defined Peptide)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 26. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ELAGIGILTV)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ELAGIGILTV)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 27. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ELAGIGILTV)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ELAGIGILTV)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 28. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ELAGIGILTV)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ELAGIGILTV)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 29. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GILGFVFTL)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GILGFVFTL)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 30. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GILGFVFTL)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GILGFVFTL)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 31. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GILGFVFTL)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GILGFVFTL)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 32. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GLCTLVAML)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GLCTLVAML)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 33. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GLCTLVAML)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GLCTLVAML)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 34. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GLCTLVAML)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GLCTLVAML)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 35. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GLIQLVEGV)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GLIQLVEGV)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 36. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GLIQLVEGV)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GLIQLVEGV)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 37. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(GLIQLVEGV)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(GLIQLVEGV)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 38. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ILAKFLHWL)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ILAKFLHWL)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 39. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ILAKFLHWL)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ILAKFLHWL)/FITC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 40. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ILAKFLHWL)/RPE, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ILAKFLHWL)/RPE, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 41. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ILKEPVHGV)/APC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ILKEPVHGV)/APC, 50 tests, 0.5 mL, 150 tests, 1.5 mL, 500 tests, 5 mL, 1000 tests, 10 mL. 42. Антитела для определения антиген-специфичных Т-клеток HLA-A*0201(ILKEPVHGV)/FITC, 50 тестов, 0.5 мл, 150 тестов, 1.5 мл, 500 тестов, 5 мл, 1000 тестов, 10 мл, HLA-A*0201(ILKEPVH... Показана усеченная версия данных из-за ограничений используемого программного обеспечения. Полную версию вы можете просмотреть на официальном сайте Росздравнадзора: http://roszdravnadzor.ru/services/misearch.

Проточные цитофлуориметры (цитометры) - высокопроизводительные системы анализа частиц (как правило, клеток) в потоке жидкости. Анализ частиц ведется с большой скоростью (до десятков тысяч в секунду), причем каждая частица анализируется отдельно. Метод проточной цитометрии позволяет получать за короткое время качественные и количественные данные по анализируемым частицам с высокой статистической достоверностью.

Проточные цитометры используются для широкого круга задач, связанных с анализом клеток, таких как подсчет клеток, иммунофенотипирование (в иммунологии, гематологии, онкологии, при культивировании клеток и пр.), клеточный цикл и пролиферация, клеточное здоровье и апоптоз, автофагия, клеточный сигналинг, токсикология, эффективность трансфекции и т.д. Типичные объекты - клетки человека и животных, клетки растений и микроводоросли, дрожжи, бактерии, микрочастицы и экзосомы.

Центральным элементом проточного цитометра является проточная ячейка, в которой клетки выстраиваются друг за другом в ламинарном потоке жидкости и проходят через луч лазера. Лазерный луч, проходя через клетку, отклоняется, рассеивается и вызывает флуоресценцию красителей, которыми маркируются исследуемые структуры.

Отклоненный и рассеянный свет облучающего лазера, а также свет, полученный в результате флуоресценции, попадает на детекторы, переводится в цифровой сигнал, значение которого пропорционально интенсивности попавшего на детекторы света. Данные по интенсивности обрабатываются компьютером и выводятся в виде графиков и статистических характеристик.

Существует несколько типов проточных ячеек. Большинство проточных цитометров использует проточную ячейку с гидродинамической фокусировкой: ламинарный поток создается потоком обжимающей жидкости (sheath fluid), которая со всех сторон «обжимает» образец. Другой тип проточных ячеек использует капиллярные взаимодействия для создания ламинарного потока: образец подается в микрокапилляр или в чип, работающий по принципу микрофлюидики.

Скорость, с которой клетки движутся в потоке, определяет время измерения: чем выше скорость, тем быстрее проходит измерение, но выше вариабельность результатов (часто выражается в виде коэффициента вариации, CV, coefficient of variation). Высокие значения CV могут затруднить разделение популяций клеток, усложнить трактовку результатов измерения. Для уменьшения CV при больших скоростях может применяться акустическая фокусировка клеток в потоке.


В качестве источника света в проточных цитометрах используются лазеры. Наиболее универсальный - голубой (длина волны 488 нм), широко распространены также красный (642 нм) и фиолетовый (405 нм) лазеры. Для решения специальных задач могут дополнительно устанавливаться лазеры с другими волнами излучения. От «цвета» лазера зависит выбор флуорохромов, которые можно использовать для окраски. Увеличение количества лазеров существенно расширяет этот выбор, позволяет подбирать более эффективные комбинации флуорохромов для характеристики клеток, увеличивать количество параметров клеток, которые можно проанализировать за одно измерение.

В системах с несколькими лазерами свет, полученный при облучении клетки, может собираться для всех лазеров одновременно (коллинеарные системы) или для каждого лазера отдельно (например, при пространственном разделении точек облучения клеток каждым лазером). В последнем случае можно в рамках одного измерения использовать флуорохромы, имеющие сходный спектр эмиссии, если они различаются по спектру возбуждения.


В качестве детекторов светового сигнала от клеток в традиционных проточных цитометрах используются PMT (photomultiplier tube, фотоумножители), которые представляют собой вакуумную лампу с двумя основными электродами (катод и анод) и несколькими промежуточными (диноды). Свет, полученный при облучении клеток, падает на фотоэлектрод PMT и выбивает из него электроны. Эти электроны летят к диноду и каждый из них выбивает еще несколько, которые летят к следующему диноду и т.д. Таким образом, PMT не только преобразует световой сигнал в электрический, но и значительно его усиливает. Благодаря своей чувствительности, PMT до сих остается самым распространенным детектором для проточных цитометров.
Другой вариант детекторов - фотодиоды - все больше набирает популярность с развитием технологии их производства, повышением их чувствительности.


Таким образом, фотоны света преобразуются в электрический импульс, величина которого пропорциональна попавшему на детектор свету. То есть, например, чем больше в клетке окрашенных структур, тем ярче она флуоресцирует, тем сильнее электрический сигнал, регистрируемый на детекторе. Детектор регистрирует весь свет, который на него попадает, поэтому для многоцветного анализа весь спектр, который приходит от клеток необходимо делить на узкие спектральные полоски при помощи серии фильтров, и каждый участок спектра попадает на отдельный детектор, соответствующий определенному «цвету».

В системах, использующих PMT или фотодиоды, анализируется общая интенсивность светового сигнала с каждой клетки, саму клетку, ее форму при этом увидеть невозможно. О том, что точка на графике - это именно исследуемая клетка, приходится догадываться с той или иной степенью вероятности (вместо термина «клетка» принято говорить «событие»). Проблема верификации выделенных популяций «событий» стоит остро и решается дополнительными процедурами анализа, контролями, привлечением клеточного сортинга с последующей микроскопией. Удачным сочетанием наглядности микроскопии и скорости проточной цитометрии стали визуализирующие проточные цитометры (Imaging Flow Cytometers). В качестве детектора в них используется CCD-камера. Хотя чувствительность CCD-матрицы ниже, чем PMT, ее можно значительно усилить. Так, технология TDI (time delay integration, накопление сигнала во времени) предусматривает электронное сопровождение движущихся объектов (клеток). Скорость «перемещения» засвеченных пикселей по матрице синхронизируется со скоростью клетки в потоке, собранные данные по интенсивности изображения на каждом участке матрицы накапливаются и собираются в одно изображение с повышенной яркостью и четкостью. В результате, такие системы обладают чувствительностью, не уступающей и даже превышающей чувствительность PMT. Визуализация любого события обеспечивает верификацию без дополнительных ухищрений и позволяет исследовать популяции, которые в традиционной цитометрии отбрасываются. Каждой точке на графике в визуализирующей проточной цитометрии соответствует изображение, на котором можно проследить не только наличие или отсутствие определенной структуры, но и подсчитать количество этих структур, локализацию в клетке, качественно и количественно оценить морфологию клеток.


По возможности отделить нужную популяцию от остальных клеток проточные цитометры делят на анализаторы (только логическое выделение) и сортеры (логическое и физическое выделение нужных клеток). Клеточные сортеры способны провести анализ, выбрать нужную популяцию и выделить ее в отдельную пробирку, лунку планшета или перенести на предметное стекло. Для разделения клеток большинство сортеров использует электростатическую сепарацию. После прохождения через луч лазера (т.е. после анализа) клетка изолируется в капле жидкости. В зависимости от результатов анализа капля с клеткой получает определенный электрический заряд, благодаря которому она отклоняется в электромагнитном поле и, в итоге, оказывается в пробирке с такими же клетками. Капли, не получившие заряд, попадают в слив и удаляются. В некоторых сортерах сортировка производится при помощи чипов на основе микрофлюидики.

Существуют также другие методы сортировки клеток: при помощи (MACS, magnetic-activated cell sorting), при помощи микропузырьков (BACS, buoyancy activated cell sorting), сортировка единичных клеток при помощи микрочипов.

Проточные цитометры придуманы и используются для анализа дискретных частиц: клеток животных и человека, растительных клеток, водорослей, грибов, микроорганизмов. Исследуемые структуры или вещества должны быть расположены на поверхности или внутри этих частиц. Однако существуют также приложения для исследования растворенных веществ - то, чем традиционно занимается . Для детекции на проточном цитометре растворенных аналитов их нужно связать с частицами, которые сможет «увидеть» проточный цитометр. В качестве таких частиц используют бидсы (beads) - полимерные микросферы, сопоставимые по размеру с клетками (5-15 мкм), с которыми прочно связывают (иммобилизируют) антитела к исследуемому аналиту. В растворе молекулы аналита связываются с нанесенными на бидсы антителами, далее аналит дополнительно метят флуоресцентным красителем (также при помощи антител). По яркости флуоресценции этого красителя судят о концентрации аналита в растворе. Развитие этого метода привело к созданию .

По спектру решаемых задач можно разделить проточные цитометры на открытые и закрытые. В открытых системах (большинство проточных цитометров) задачи и способ их решения определяются пользователем и ограничены только возможностями прибора и фантазией исследователя. Закрытые системы ориентированы на решение специализированных задач (одной или нескольких), методы анализа и, зачастую, реагенты определяются производителем этих приборов. Преимущества таких приборов – простота в использовании, минимальная необходимость оптимизации метода, зачастую меньшая цена, чем у открытых систем.

При выборе проточного цитометра стоит обращать внимание на следующие факторы:

  • какие наиболее типичные измерения, какие цветовые комбинации будут использоваться, какие характеристики прибора должны быть для проведения измерений: количество лазеров, количество флуоресцентных параметров;
  • тип детекторов флуоресценции (возможность визуализации);
  • разрешающая способность - способность различать тускло окрашенные популяции;
  • скорость анализа (актуальна при анализе редких популяций), складывается из возможного количества событий в секунду и скорости потока;
  • точность измерения, коэффициент вариации (CV) - особенно актуально при анализе клеточного цикла;
  • минимальный размер анализируемых частиц (актуально для изучения микроорганизмов и микровезикул);
  • наличие автосэмплера для автоматического анализа из нескольких пробирок или лунок планшета существенно освобождает время исследователя.
Специалист Диаэм по проточной цитометрии и мультиплексному анализу всегда поможет вам с подбором оптимальной модели.

Частично задачи можно решать на других приборах:

  • подсчет клеток и анализ из жизнеспособности -

Проточная цитофлуориметрия - необычайно функциональный метод, который позволяет разносторонне анализировать различные популяции клеток, причем не «в среднем», а каждую клетку в отдельности. Метод разработали еще в середине 20 века, а ныне его используют не только ученые, но и врачи-клиницисты. Несмотря на то, что проточную цитофлуориметрию нельзя назвать простой (сложное оборудование, трудности пробоподготовки и интерпретации результатов), она становится всё более и более популярной. В этом обзоре мы расскажем об основных достоинствах метода, его возможностях и, конечно, о необходимых тонкостях «кухни» цитометриста.

Генеральный партнер цикла - компания : крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Одна из главных миссий «Биомолекулы» - докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи - мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?

И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны - чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!

Особенно важно, что иногда отличить разные клетки при помощи микроскопии не представляется возможным: в микроскоп они просто-напросто выглядят одинаково. А ведь нам зачастую нужно не просто отличить одни клетки от других, но и проанализировать те или иные их параметры: выживаемость, экспрессию белков, целостность ДНК и многое другое.

В этом случае на помощь и придет проточная цитометрия. Ее физические принципы весьма просты. Суспензия клеток, предварительно помеченных светящимися молекулами (флуорохромами ), помещается в поток жидкости, пропускаемый через проточную ячейку. Получается как бы «поток в потоке», что порождает эффект гидродинамического фокусирования: исследуемые клетки выстраиваются в цепочку и в таком порядке пересекают пучок световых (обычно лазерных) лучей, служащих для анализа каждой отдельно взятой клетки.

Свет, исходящий от флуорохромов, фокусируют при помощи оптической системы, состоящей из нескольких зеркал и линз, а затем раскладывают на определенные компоненты. Полученные световые сигналы преобразуют в электрические импульсы и анализируют при помощи специального программного обеспечения.

Таким образом, результат цитометрического анализа - определение состояния каждой клетки в каждой из популяций образца. Всего за несколько десятков секунд сквозь проточную ячейку проходят тысячи клеток, позволяя исследователю сделать вывод о составе и характеристиках клеточной суспензии. Также при помощи проточного цитометра можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце с использованием калибровочных счетных микросфер или волюметрическим методом - прекрасная, хоть и дорогая, альтернатива камере Горяева !

Преимущества проточной цитометрии

Проточная цитометрия является достаточно мощным методом с массой уникальных достоинств:

  • быстрый анализ (до 30 000 событий в секунду);
  • анализ большого количества клеток (до 10 6 –10 8 клеток в образце);
  • количественное измерение интенсивности флуоресценции;
  • получение данных для каждой конкретной клетки;
  • одновременный анализ разных процессов;
  • разделение популяций, а значит, возможность анализировать происходящее только в минорной популяции, не проводя для этого дополнительных операций для ее выделения или концентрирования;
  • удобная работа с данными - аккуратная статистическая обработка, качественная визуализация.

История одной военной разработки

Метод проточной цитометрии возник на основе опытов по подсчету числа и измерению размеров частиц, проведенных еще в эпоху Второй мировой войны (рис. 1). Первая публикация о возможности подсчета бактерий в капилляре при помощи фотоэлектрических эффектов появилась в 1934 году . За военные и послевоенные годы на основании этого метода разработали счетчик микроорганизмов в аэрозолях, чтобы ускорить идентификацию бактерий и спор в воздухе при использовании биологического оружия . Поток воздуха проходил через освещенное поле в камере анализа, где в качестве источника света использовали лампу от фары автомобиля Ford, а также были установлены детектор с фотоумножителем.

Вторая актуальная практическая задача - подсчет и разделение клеток крови - повлекла за собой дальнейшее развитие технологии, и в 1954 году вышел счетчик клеток Coulter Counter Model A , получивший широкое применение в клинической гематологии.

Первый проточный цитометр, использующий флуоресценцию (ICP11 ), сконструировал в 1968 году Вольфганг Гёде (Wolfgang Göhde ) в университете германского города Мюнстера. Уже год спустя прибор был выпущен на рынок немецкой компанией Partec . Однако в то время методы, основанные на абсорбции, пользовались гораздо большей популярностью, чем применение флуоресцентных меток. Первоначально проточную цитометрию назвали импульсной цитофотометрией. За следующие 10 лет вышло еще несколько коммерческих моделей цитометров: Cytoflourograph (1971) от Bio/Physics Systems Inc, PAS 8000 (1973) от Partec, FACS (1974) от Becton Dickinson, ICP 22 (1975) от Partec/Phywe и Epics от Coulter (1977–1978). Эти приборы уже обладали способностью измерять интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и определять сразу несколько параметров клеток. В 1978 году на конференции Американского инженерно-технического фонда предложили назвать метод проточной цитометрией . Это название приобрело популярность и используется до сих пор.

Сейчас выпускают два основных типа приборов для проточной цитометрии:

  1. простые в использовании аппараты, которые могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и светорассеяние под углом около 10° (малоугловое прямое рассеяние) и 90°;
  2. большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять и более клеточных или ядерных параметров, но и автоматически сортируют частицы с заданным набором этих параметров по отдельным фракциям.

Рисунок 1. Основные исторические вехи на пути развития проточной цитометрии. 1934 г. - Первая публикация с упоминанием полуавтоматического проточного оптического счетчика клеток. 1947 г. - Публикация схемы фотоэлектрического счетчика для анализа бактериальной загрязненности воздуха . 1949 г. - Патент Уолласа Коултера Means for counting particles suspended in a fluid . 1965 г. - Первый волюметрический проточный анализатор . 1969 г. - Первый коммерческий флуоресцентный проточный анализатор (цитометр) (Wolfgang Göhde , ICPII , Partec ). 1973 г. - BD FACS-1 - первый проточный флуоресцентный сортер-анализатор . 1980–2000-е гг. - Выход на коммерческий рынок решений для цитофлуориметрии и сортинга, дальнейшее совершенствование метода. Рост числа параметров от 3–4 до 20+ (BD LSR-II , Cytopea Influx ). 2005 г. - Первый проточный цитометр с визуализацией Amnis ImageStream 100 . 2009 г. - Первый коммерческий инструмент для масс-цитометрии CyTOF 2 . 2016 г. - BD выпускает на рынок анализатор BD Symphony с потенциальными возможностями по детекции до 50 параметров.

Основные принципы метода

Суть проточной цитометрии, пожалуй, можно изложить всего одним предложением: поток клеточной суспензии в ячейке сжимается, клетки выстраиваются в очередь и проходят через лазерный луч, регистрация рассеяния от которого позволяет охарактеризовать каждую клетку в потоке индивидуально. Этот процесс изображен на рисунке 2.

Рисунок 2. Устройство проточной ячейки цитометра. В основе любого проточного цитометра лежит использование системы гидродинамической фокусировки либо микрокапиллярной системы. Гидродинамическим фокусированием называется процесс, при котором суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, причем образуется как бы «поток в потоке»: поток с клетками «встраивается» внутрь потока обжимающей жидкости. За счет разности давлений между образцом и обжимающей жидкостью поток сужается до диаметра одной клетки, поэтому через ячейку клетки проходят по одной, как это показано на рисунке. Далее происходит лазерное облучение клетки, меченной флуорохромом, и регистрация ответного сигнала.

Клетки, исследуемые цитометрией, метят флуорохромами, поэтому лазерный луч возбуждает вторичное свечение (флуоресценцию). Затем сигналы флуоресценции и светорассеяния регистрируются различными детекторами (рис. 3). Информация от детекторов используется компьютерным алгоритмом, который позволяет в наглядной форме «посчитать» клетки и разделить их на отдельные популяции, отличающиеся друг от друга по каким-то важным параметрам, интересующим исследователя.

Рисунок 3. Внутреннее устройство проточного цитометра. Типовая схема прибора с одним лазером, двумя детекторами светорассеяния (боковое и малоугловое, то есть прямое) и тремя флуоресцентными детекторами. Принципиальное устройство проточной ячейки отдельно показано на рис. 2.

В зависимости от используемых флуорохромов требуются разные длины волн для их возбуждения и разные детекторы (фильтры) для анализа испускаемого свечения. В современных приборах (рис. 4) может быть до 7 лазеров и до 30 каналов детекции, но для большинства приложений достаточно 1–3 лазеров и 4–10 каналов. Такие сложные конфигурации позволяют проводить многопараметрический анализ, когда одна клетка связана с несколькими флуорохромами с отличными друг от друга длинами волн испускания, а нередко - и возбуждения. Это позволяет исследовать сразу несколько свойств клеток из одной пробы, что экономит время анализа и расход анализируемого образца. Подробнее этот вопрос рассмотрен в следующих разделах.

Рисунок 4а. Современные проточные цитофлуориметры. Компактный цитометр Beckman Coulter Cytoflex.

Рисунок 4б. Современные проточные цитофлуориметры. Настольный цитометр BD Fortessa X20.

Рисунок 4в. Современные проточные цитофлуориметры. Цитометр Beckman Coulter Gallios для рутинных клинических анализов с «каруселью» на 32 пробирки для быстрого потокового измерения большого количества проб.

Рисунок 4г. Современные проточные цитофлуориметры. Блок из четырех лазеров с возможностью одновременного использования до 20 детекторов в цитометре BD Fortessa X20 .

Рисунок 4д. Современные проточные цитофлуориметры. Детекторный блок сортера-анализатора BD Influx (5 лазеров - 24 параметра).

Рисунок 4е. Современные проточные цитофлуориметры. Проточная ячейка BD Fortessa X20 в тестовом режиме.

Словарик

CD-маркеры поверхностные белки клеток крови, характерактеризующие определенные стадии их дифференцировки. Название происходит от кластеров дифференцировки (англ. C luster of D ifferentiation ). Антитела (иммуноглобулины) белковые соединения плазмы крови, образующиеся в организме теплокровных животных в ответ на появление бактерий, вирусов, белковых токсинов и других антигенов . В медицине и технологии получили широкое распространение моноклональные антитела . Гейт выбранная для анализа область на одно- или двумерной диаграмме, полученной в ходе цитометрических измерений. Гидродинамическое фокусирование перераспределение суспензии клеток в поток, равный размеру одной клетки. За счет разности давлений между образцом и обжимной жидкостью клетки выстраиваются в «колонну по одному». Лазер монохроматичный когерентный источник света, что означает постоянную длину волны и определенную поляризацию. Проточная ячейка рабочая емкость проточного цитофлуориметра, в которую подается анализируемая суспензия клеток. Благодаря эффекту гидродинамического фокусирования, в проточной ячейке клетки выстраиваются в цепочку, что делает возможным их индивидуальное облучение лазером и регистрацию рассеянных лучей. Светорассеяние рассеяние электромагнитных волн видимого диапазона при их взаимодействии с веществом. При этом происходит изменение пространственного распределения, частоты, поляризации оптического излучения и других параметров. Флуоресценция кратковременное поглощение кванта света флуорохромом с быстрым переизлучением другого кванта, как правило, с большей длиной волны. Регистрация флуоресценции - один из наиболее популярных приемов в микроскопии и молекулярной биологии . Флуорохром флуоресцирующий краситель, который после облучения светом определенной длины волны испускает характерное свечение за счет перехода электронов между различными энергетическими уровнями. Цитофлуометрия (проточная цитометрия) метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции.

Что «видит» цитометрия?

Прямое и боковое светорассеяние

Проточный цитометр обладает двумя детекторами светорассеяния, позволяющими делать выводы о размерах и структуре клеток (рис. 5):

  1. Детектор прямого (малоуглового) светорассеяния (forward scatter, FS ) располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки.
  2. Детектор бокового светорассеяния (side scatter, SS ). Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого бокового светорассеяния позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро/цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений).

Рисунок 5. Прямое и боковое светорассеяния регистрируются каждое своим детектором , что позволяет измерить базовые параметры клеток (размер и внутреннее строение). Детектор прямого светорассеяния находится прямо по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и улавливает свет, углы рассеяния которого не превышают 9–12 градусов. Прямое светорассеяние дает исследователю информацию о размере клетки. Боковое светорассеяние позволяет судить о наличии в клетке гранул, соотношении ядро/цитоплазма и других параметрах - за счет того, что проходящий сквозь клетку луч преломляется и рассеивается во все стороны.

Комбинация бокового и прямого светорассеяний позволяет судить о морфологии клетки в целом и выделять различные популяции клеток для дальнейшего анализа. Например, использование только двух перечисленных выше детекторов позволяет провести первичный анализ популяций лейкоцитов с помощью диаграммы бокового-прямого (SS-FS) светорассеяния (рис. 6).

Рисунок 6. Диаграмма бокового-прямого (SS-FS) светорассеяния для суспензии белых клеток крови. Лимфоциты являются самыми маленькими клетками с круглым ядром, тогда как для нейтрофилов характерен не только бóльший размер, но и полиморфоядерность, а потому на этой диаграмме они располагаются выше и правее.

Визуализирующая проточная цитометрия: технология Amnis FlowSight от Merсk (Millipore )

Классическая проточная цитометрия имеет один существенный недостаток - при появлении в исследовании редких событий, как правило, невозможно установить, что это: мусор (останки погибших клеток) или редкая уникальная субпопуляция. У исследователя нет возможности визуализировать эти клетки, чтобы в деталях разобраться с ними. Обычно такие события просто исключается из анализа данных. Между тем, именно эти «артефакты» могут представлять большую научную ценность.

Тем не менее существуют решения, позволяющие рассмотреть каждую клетку, проходящую через анализатор, индивидуально и тем самым совместить высокую скорость анализа проточного цитофлуориметра с возможностью морфологического анализа флуоресцентного микроскопа с хорошим разрешением.

Технология визуализации в проточной цитометрии реализована в цитофлуориметрах и от компании . При использовании данной технологии прибор фиксирует изображение каждой (!) клетки, проходящей через зону детекции. Пользователю достаточно кликнуть курсором на интересующую область на диаграмме, чтобы получить изображения клеток, которые были проанализированы.

Бесспорное преимущество такой технологии - возможность «увидеть», в прямом смысле этого слова, каждую анализируемую клетку и понять что это: мусор или же редкая атипичная форма клетки. Это позволяет существенно расширить потенциал метода проточной цитометрии, дополнив его возможностями современной клеточной микроскопии.

Поскольку данное решение позволяет проводить и классифицировать популяции клеток по их морфологии, эту технологию по достоинству оценили гидробиологи: приборы и широко применяют для изучения микроводорослей и простейших, населяющих мировой океан.

Дополнительная информация по теме на сайте «Диаэм»:

  • Антитела для проточной цитофлуориметрии (Abcam )
  • Интерактивная таблица для подбора флуоресцентно меченых антител (Abcam )

Материал предоставлен партнёром - компанией «Диаэм»

Детекторы флуоресценции

Система для регистрации свечения флуоресцентных меток (детектор флуоресценции, канал флуоресценции) состоит из комплекса светофильтров, зеркал и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в определенном диапазоне длин волн, соответствующем измеряемому флуорохрому.

Основное преимущество цитофлуориметрии заключается в том, что клетка может быть окрашена несколькими флуоресцентными метками одновременно, что позволяет проводить мгновенный многопараметрический анализ. Например, из одной пробы можно получить информацию о содержащихся в ней разных популяциях клеток, а также для каждой популяции из пробы измерить уровень апоптоза, пролиферации, экспрессии клеточных рецепторов и иные показатели.

Эта особенность хорошо иллюстрируется старой притчей о семи слепцах, ощупывающих слона. Только сложив то, что говорил о своих впечатлениях каждый из них, можно получить более-менее полное представление о том, как на самом деле выглядит слон. На рисунке 7 изображена схема дифференцировки Т-клеток в восемь различных популяций и CD-маркеры , характерные для каждой из них. Проточная цитометрия позволяет получить данные обо всех популяциях в образце Т-клеток и выявить интересующие свойства каждой из них.

Рисунок 7. Схема дифференцировки Т-клеток в крови пациента на основании содержания CD-маркеров. Дифференцировка Т-лимфоцитов похожа на дерево, каждая ветвь в котором обладает своими свойствами и своими поверхностными маркерами. Цитометрический анализ CD-маркеров позволяет обнаружить ошибки дифференцировки, приводящие, например, к аномально высокому содержанию клеток минорных популяций или, напротив, отсутствию конечно дифференцированных клеток. Подобные исследования часто применяют для оценки состояния и иммунного статуса пациента при проведении химиотерапии. Результат анализа представляет собой множество двумерных диаграмм, по виду и логике подобных тем, что изображены и описаны на рис. 14.

Полученные с цитометра данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или дву- и трехмерных диаграмм. Анализ этих данных позволяет определить количество клеток, отвечающих тем или иным условиям, оценивая интенсивность флуоресценции (то есть количество того или иного маркера в клетке).

Основные типы красителей

Главное свойство красителей для проточной цитометрии - флуоресценция . Их можно разделить на три группы по принципу связывания с клеткой или ее фрагментами:

Флуорохромы, используемые самостоятельно или же как метки для антител, можно разделить на несколько групп в зависимости от принципа флуоресценции и их химического состава.

Флуорохромы

Флуорохромы (флуоресцентные красители ) - вещества, которые способны связываться с объектом и при освещении светом флуоресцировать, то есть поглощать энергию света и переизлучать ее с бóльшей длиной волны (см. рис. 8).

Известные «классические» красители - FITC (флуоресцеина изотиоцианат), (фикоэритрин), APC (аллофикоцианин) и PerCP (перидининхлорофилл протеин). Современные коммерческие красители марки Alexa Fluor более стабильны и ярче флуоресцируют, так как являются сульфитными производными кумарина, родамина, флуоресцеина и т.д. Также в последние годы активно набирают популярность красители, возбуждаемые лазерами 355 и 405 нм, которые используются в новых моделях цитометров (табл. 1).

Таблица 1. Наиболее популярные красители, используемые в проточной цитометрии, и их характеристики. По материалам с сайта www.bio-rad-antibodies.com
Флуорофор Цвет флуоресценции Длина волны возбуждения, нм Длина волны испускания, нм
DyLight 405 400 420 3
Alexa Fluor 405 401 421 3
Pacific Blue 410 455 1
Alexa Fluor 488 495 519 3
FITC 490 525 3
DyLight 550 562 576 4
PE 490; 565 578 5
APC 650 661 4
Alexa Fluor 647 650 665 4
DyLight 650 654 673 4
PerCP 490 675 2
Alexa Fluor 700 Infrared 702 723 2

Что делать, если цитофлуориметр оснащен всего одним лазером, а экспериментатору необходимо измерить три или четыре параметра с минимальным «засветом» друг на друга? Есть хорошее решение - использовать так называемые тандемные красители (рис. 8): это два флуорохрома, ковалентно соединенные между собой через «мостик» (спейсер). Когда первый краситель возбуждается и переходит в синглетное состояние , его энергия передается на второй краситель. Это активирует второй флуорохром, флуоресценцию которого и регистрирует цитометр. Этот процесс называется флуоресцентным резонансным переносом энергии (FRET ) . Такие красители разработали для увеличения количества флуоресцентных каналов, которые могут быть использованы при наличии одного возбуждающего лазера (табл. 2).

Рисунок 8. Тандемные красители: когда одного флуорохрома недостаточно. Слева: упрощенная схема тандемного красителя (без спейсеров), состоящего из двух молекул - донора (A) и акцептора (B). Показаны также энергетические уровни возбуждения и испускания флуоресценции. Справа: сдвиг Стокса , лежащий в основе действия тандемных красителей. Благодаря этому эффекту цвет флуоресценции всегда «более красный», нежели возбуждающий свет.

Таблица 2. Тандемные красители и их основные характеристики. PE-Cy5 - фикоэритрин-Cy5; PE-Cy7 - фикоэритрин-Cy7. По материалам с сайта www.bio-rad-antibodies.com
Флуорофор Цвет флуоресценции Длина волны возбуждения, нм Длина волны испускания, нм Относительная яркость свечения
PE-Alexa Fluor 647 496; 546 667 4
PE-Cy5 496; 546 667 5
PE-Cy5.5 496; 546 695 4
PE-Alexa Fluor 750 Infrared 496; 546 779 4
PE-Cy7 Infrared 496; 546 785 2

Большинство тандемных красителей рассчитано на наиболее распространенные лазеры с длинами волн 488 (синий) и 640 (красный) нм. Тандемные красители применяют для многоцветного анализа, особенно в комбинации с одиночными. Например, комбинация из четырех красителей - два одиночных (FITC и PE) и два тандемных (PE-TexasRed и PE-Сy7) - возбуждается одним 488-нанометровым лазером, и при этом испускает в зеленом, желтом, красном и инфракрасном каналах соответственно, то есть позволяет проводить параллельную регистрацию четырех различных параметров, имея всего один лазер вместо двух или даже трех. В настоящее время разработаны также полимерные «квазитандемы» для лазеров 355 и 405 нм.

Флуоресцентные белки

Рисунок 12. Детекция апоптоза в нейтрофилах человека. Нейтрофилы обработали реагентом, стимулирующим апоптоз, а далее окрасили последовательно ДНК-связывающим красителем (здесь использовали PI, но можно взять и любой другой, интеркалирующий с ДНК), не способным проникать через мембрану живой клетки, и флуоресцентно-меченым белком аннексином, связывающимся с фосфатидилсерином на внешней мембране: схематично процесс показан слева . Справа изображена двумерная диаграмма с флуоресценцией аннексина и PI по осям, где мы видим три разные популяции: V - живые клетки; Ap - клетки на ранней стадии апоптоза (появление фосфатидилсерина во внешнем липидном слое); Ap/N - на поздней стадии апоптоза и во время некроза (нарушена асимметрия липидов и целостность поверхностной мембраны клеток).
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Фагоцитоз

Анализ фитопланктона

Цитометрия позволяет померить не только те клетки, что внутри нас, но и те, что населяют окружающие нас водоемы и входят в различные экологические цепочки - например, фитопланктон (рис. 13). Его количество и биомасса используются при биологическом анализе водных сред и оценке их экологического состояния. Проточная цитометрия приобретает большую популярность в экспресс-мониторинге водоемов, потому что в клетках фитопланктона уже содержится какой-либо флуоресцентный пигмент - например, фикоэритрин или хлорофилл.

Рисунок 13. Экологический анализ водоемов: наблюдаем за фитопланктоном. Цитометрические диаграммы позволяют разделять клетки фитопланктона за счет различного содержания фикоэритрина и хлорофилла и, соответственно, разницы в их флуоресценции. По осям - интенсивность флуоресценции в каналах FL2 (575 нм, фикоэритрин) и FL4 (695 нм, хлорофилл). Слева - различные культуры фитопланктона в «контрольном» водоеме. Справа - эксперимент, который при сравнении с контролем показывает, что в анализируемом водоеме присутствуют не только ожидаемые группы 1–5 (криптофиты, хлорофиты), но и несколько новых популяций: они отмечены цифрами 6–9. Дальнейший анализ по наличию фикоцианина, размера и сравнению с контрольными образцами микроорганизмов позволяет определить конкретный состав фитопланктона с очень большой точностью.

«Перепись населения» среди клеток крови

Многие клетки - например, лимфоциты - совершенно неотличимы не только «на глазок», но и для более тщательных методов анализа. Но, тем не менее, они выполняют очень разную работу и все-таки могут быть разделены на субпопуляции - по различным молекулам, которые они синтезируют на своей поверхности. Чаще всего это рецепторы, называемые маркерами, и их можно распознавать при помощи флуоресцентно меченных антител, которые уже регистрируются цитометрией.

Например, по наличию различных CD-маркеров можно провести «перепись» Т-лимфоцитов в цельной крови, что активно применяют в клинических исследованиях для выявления хронических инфекционных и аутоиммунных заболеваний, диагностики первичных иммунодефицитов, а также оценки эффективности проводимого лечения.

На рисунке 14 изображена схема эксперимента по анализу дифференцировки тимоцитов мыши и приведены первичные данные с проточного цитометра по оценке популяций и апоптоза. Все Т-клетки берут начало от гемопоэтических стволовых клеток красного костного мозга, которые мигрируют в тимус и дифференцируются в незрелые тимоциты. За их дифференцировкой можно следить по экспрессии поверхностных маркеров (см. рис. 7). Несмотря на кажущуюся сложность рисунка, на этом примере явственно прослеживается основная логика постановки любого многопараметрического измерения.

Рисунок 14. Пример использования многоцветного цитометрического анализа для анализа дифференцировки и жизнеспособности тимоцитов мыши - подробная схема анализа результатов. Сверху: схема дифференцировки тимоцитов мыши, некоторые характеристики рецепторов и типичных поверхностных маркеров. Снизу: схема анализа популяции тимоцитов в образце.

  1. Разделение тимоцитов мыши на 4 типа: по наличию или отсутствию у них CD4 и CD8 маркеров. Принятые обозначения стадий развития Т-клеток определяются экспрессией корецепторов: DN (от Double-Negative , CD4 − CD8 −) - двойные отрицательные;DP (от Double-Positive , CD4 + CD8 +) - двойные положительные;SP (от Single-Positive , CD4 + CD8 − и CD4 − CD8 +) - одинарно положительные. Проценты на рисунке - количество клеток данного типа по отношению к общему количеству. Используемые метки: PC5.5 и PC7.
  2. Разделение популяции DN-тимоцитов, которые находятся в начале пути дифференцировки, еще на четыре субпопуляции по содержанию в них маркеров CD25 и CD44 (см. таблицу вверхней части рисунка): DN1, DN2, DN3, DN4. Используемые метки: APC и PE.
  3. Определение для субпопуляции DN4 уровня апоптоза, составляющего 32%, по окрашиванию меченным FAM панкаспазным ингибитором (FAM-FLICA poly caspase ).

Хромосомный анализ

Многие врожденные заболевания и аномалии вызваны нарушениями в числе (анеуплоидия) и структуре хромосом, выявить которые помогает в том числе и цитометрия (рис. 15) . Хромосомный анализ назначают при трудностях с зачатием ребенка или же для подтверждения диагноза пациента. Например, можно быстро выявить случаи трисомии 21-й хромосомы (когда присутствуют три, а не две копии этой хромосомы), что является признаком синдрома Дауна . Также часто обнаруживают трисомии половых хромосом, возникающие при синдромах Клайнфельтера , Эдвардса и Патау . Количественные аномалии аутосом (хромосом 1–22) являются причиной 0,5–1% всех аномалий строения и встречаются с частотой 1:700.

Правда, существует сложность: на цитометре невозможно разделение 9–12 хромосом (хотя некоторые исследователи эту проблему решают, прибегая к разным ухищрениям ).

Рисунок 15. Кариотип здорового человека (женщины). Хромосомы окрашены красителями Hoechst 33258 и хромомицином A3 (CA3). Двойное окрашивание необходимо, чтобы достичь лучшего разрешения данных - Hoechst 33258 связывается с AT-богатыми областями, а хромомицин А3 указывает на GC-богатые участки. Полученные данные свидетельствуют о том, что пациент - женщина без хромосомных аномалий.

Для получения максимально корректных результатов при цитометрическом анализе хромосом, анализ проводят в клетках, находящихся в экспоненциальной фазе роста. Клетки премеабилизуют и окрашившивают двумя ДНК-связывающими красителями. Например, хромомицином А3 (СА3), который связывается с CG-богатыми регионами и Hoechst 33258, окрашивающим АТ-богатые части ДНК. Хромосомы разделяют по количеству содержащейся ДНК и соотношению пар оснований.

Пролиферация и клеточный цикл

Клетки постоянно развиваются, делятся и часто превращаются в клетки других типов. Для аккуратной работы с ними всё это необходимо принимать во внимание. Анализ пролиферации и клеточного цикла позволяет сделать выводы о состоянии клеточной культуры, оценить ее жизнеспособность, а также пригождается при разработке новых соединений и оценке их «полезности» для клеток. Есть несколько подходов, многие из которых уже знакомы читателю по разделу :

Рисунок 16. Анализ циклов пролиферации клеток. К клеточной культуре добавлен краситель на основе эфира карбоксифлуоресцеина (CFSE), который ковалентно связывается с белками цитоплазмы делящихся клеток. На диаграмме видны хорошо отделимые пики митозов - M1, M2, ..., M8. Каждый следующий пик находится левее предыдущего, поскольку соответствует вдвое снижающейся интенсивности флуоресценции при каждом митозе.

Внутриклеточные медиаторы и белки

Каждая клетка является впечатляющей по своей сложности смесью белков, нуклеиновых кислот, метаболитов и других веществ. Проточная цитометрия позволяет анализировать экспрессию и локализацию внутриклеточных белков, фактически заменяя вестерн-блоттинг . Выше мы рассматривали определение популяций клеток по поверхностным маркерам и анализ клеточных делений по экспрессии циклинов внутри клетки. Эти два эксперимента можно объединить! Например, определять количество клеток, которые не только содержат целевой белок, но и относятся к определенной подгруппе. Грамотный подбор антител позволяет анализировать несколько внутриклеточных белков за раз.

Однако анализ внутриклеточных белков трудоемок из-за пробоподготовки: клетки необходимо окрасить на поверхностные маркеры, фиксировать, пермеабилизировать (изменить проницаемость клеточной мембраны, чтобы доставить первичные антитела внутрь клетки), заблокировать неспецифическое связывание и далее провести окрашивание флуоресцентно меченными вторичными антителами к целевому белку.

В качестве примера можно рассмотреть анализ экспрессии фосфокиназ в клетке (рис. 17). Фосфокиназы переносят фосфатную группу с АТФ на белок, что часто является «активатором» передачи сигналов в биохимических каскадах, поэтому на основе этого анализа можно изучать множество процессов: трансдукцию сигнала внутрь клетки, наличие лейкозов и иммунодефицитов (активацию или изменение некоторых сигнальных путей), факторы патогенности микроорганизмов.

Рисунок 17. Анализ экспрессии фосфокиназ в Т-клетках. Фосфокиназы осуществляют перенос фосфатной группы с АТФ на белок, который в результате часто оказывается «активированным». Слева - схема переноса фосфатной группы при помощи фосфокиназы. Справа - сравнение экспрессии фосфокиназы (ERK 1/2) в активированных Т-клетках с контрольными Т-клетками, а также с изотипическим контролем (неспецифическим связыванием вторичных меченных антител в отсутствии первичных).
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Проницаемость мембраны

Мембрана клетки - одна из главных составляющих частей живых организмов ; ее проницаемость тщательно регулируется. Для большинства веществ она непроницаема, но за счет многочисленных рецепторов и каналов эта проницаемость может выборочно меняться для конкретных веществ или в целом. Например, проницаемость мембраны часто служит маркером начавшихся некротических процессов. А иногда исследователь специально «дырявит» мембрану в ходе трансфекции, чтобы доставить генетический материал внутрь клетки. Чтобы оценить состояние мембраны, к клеткам необходимо добавить краситель, в норме не способный проникать внутрь здоровой клетки. Обычно для этих целей применяют красители типа 7-AAD или PI (интеркалируют в ДНК) или краски типа ZombieRed (связываются с белками) (рис. 18).

Рисунок 18. Принцип действия красителей типа PI, 7-AAD и Zombie. Интеркалирующие красители проникают внутрь клетки только в случае, если целостность мембраны нарушена (например, это характерно для поздних стадий апоптоза и некроза), и связываются с ДНК. Красители серии Zombie взаимодействуют с первичными аминогруппами белков. Мембрана живых клеток непроницаема для этих красок, поэтому они связываются только с белками на поверхности, и сигнал при измерении на цитометре получается слабый. Мембрана некротических клеток проницаема, поэтому Zombie связывается и с внутриклеточными белками, что делает флуоресценцию гораздо ярче.

Измерение pH

Рисунок 19. Цитофлуориметрическая диагностика гематопоэтических болезней на примере анализа фракции ретикулоцитов. Разделение эритроцитов и их предшественников ретикулоцитов проводят при помощи окрашивания содержащейся в ретикулоцитах РНК тиазолом оранжевым. На левой диаграмме видны тромбоциты (черные ) и эритроцитарная фракция (красные ). Анализ связывания РНК с тиазолом в эритроцитарной фракции позволяет отметить регионы с разным уровнем флуоресценции: high (H), medium (M) и low (L), соответствующие стадиям созревания ретикулоцитов.
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Особенности и «кухня» проточной цитометрии

Всем ученым хорошо известно - во многом успех эксперимента зависит не только от прямых рук и качественных реактивов, но и от грамотного плана работы. Любую цитометрическую методику, прежде чем приступать к измерениям, необходимо проверить и отладить именно на вашей экспериментальной модели. Пренебрежение основными правилами и необходимыми контрольными измерениями очень рискованно, ведь в этом случае собранные за недели упорной работы данные могут отправиться не в престижный журнал, а в корзину! Итак, что необходимо учесть?

Ложные результаты

К сожалению, на проточном цитометре можно получить ложноположительные или ложноотрицательные результаты эксперимента, если забыть про два важных факта - аутофлуоресценцию клеток и неспецифическое связывание антител.

  • Аутофлуоресценция. Некоторые клетки обладают собственной (ауто-) флуоресценцией. Перед проведением любых экспериментов обязательно проверьте на цитометре, не «светятся» ли ваши клетки, а также как выглядит проба, обработанная полностью в соответствии с планируемым протоколом, но в которую не были добавлены красители. Если вы видите аутофлуоресценцию, необходимо принимать за ноль именно ее!
  • Неспецифическое связывание. При использовании антител необходимо помнить, что они могут не только распознавать целевой белок, но и неспецифически связываться с чем-то еще. Уберечься от ошибок можно с помощью изотипических контролей - антител, содержащих такую же F c -часть, что и целевое антитело, окрашенных той же меткой, но при этом не специфичных к целевому белку.

Вывод: Для настройки чувствительности прибора к флуоресценции необходимо использовать соответствующие изотипические контроли или образцы, окрашенные по отдельности каждым антителом, калибровочные микросферы, а также не забывать проверять аутофлуоресценцию образцов перед началом работы.

Контрольные измерения

В начале работы необходимо подумать об отрицательных и положительных контролях, которые вы будете использовать для определения области измерений, а также для проверки корректной работы прибора. Предположим, вы изучаете реакцию клеток на ваше соединение, которое может стать новым лекарственным препаратом, и хотите оценить количество апоптотических клеток в пробе (см. раздел ). Вам потребуется взять (−)-контроль, в котором абсолютное большинство клеток живые. Также пригодится (+)-контроль, где большая часть клеток находится в апоптозе под действием любого известного апоптогенного агента. Таким образом вы сможете выставить область измерения, чтобы детектировать значимые изменения.

Вывод: Критически важно правильно настроить области, изменения в которых вы планируете наблюдать (гейты). Однако эту часть работы можно сделать и после того, как вы измерите все пробы, поскольку программное обеспечение всех цитометров позволяет анализировать данные после эксперимента. Главное - сделать пробы с правильными положительными и отрицательными контролями, чтобы было с чем сравнивать.

Многоцветный анализ

Компенсация

При проведении многоцветного анализа вы неизбежно столкнетесь с тем, что некоторые флуорохромы светят не только в своем, но и в соседних каналах (хоть и слабее, чем в основном). Эта особенность может значительно исказить ваши данные, если вы примете «засветку» в другой канал за значимый результат эксперимента (рис. 20).

Рисунок 20. Схема «засветки» флуорохромов в соседние каналы при использовании прибора с 3 лазерами и 10 детекторами.
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Компенсация может быть настроена автоматически (новые приборы и специальные утилиты измеряют и рассчитывают матрицу компенсации по заданным флуорохромам) или самостоятельно (используя образцы, связанные с каждым флуорохромом по отдельности и «убирая» его свечение в нецелевом канале при помощи ПО).

Рисунок 21. Принцип FMO (Fluorescence Minus One) контроля. Предположим, что мы хотим проанализировать Т-клетки одновременно на три поверхностных маркера: два типа CD45 (RO и RA формы) и CD4. У нас есть к ним антитела с метками, которые указаны в табличке. На двумерной диаграмме PE-FITC слева изображены полностью неокрашенные клетки; красная линия соответствует «базовому» уровню - нулю). В центре представлена диаграмма для случая, когда добавлены два красителя из трех: CD45RO и CD4, имеющие небольшую засветку в PE-канал. Таким образом, клетки, содержащие CD45RA-маркер, должны оказаться выше желтой линии . Справа - диаграмма для клеток, обработанных антителами уже ко всем исследуемым маркерам, подтверждающая, что результатам можно будет верить! Но сначала аналогичным образом необходимо будет выполнить FMO-проверку и для двух других меток.
Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.

Выбор флуорохромов

Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии необходимо использовать яркие флуорохромы. Для одновременного исследования антигенов со слабым и сильным уровнями экспрессии категорически не следует брать соседние каналы, так как «сильный» антиген почти наверняка засветит весь небольшой эффект от «слабого».

Для сильных антигенов лучше выбирать каналы, которые оказывают минимальное влияние на соседние. Планирование эксперимента могут упростить утилиты типа fluorofinder.com .

Вывод: Самое важное в многоцветном анализе - настройка компенсации. Компенсацию (даже если ПО прибора позволяет настроить ее постфактум) предпочтительно все же делать перед началом работы. Это позволит вам сразу правильно оценивать получаемые результаты и грамотно планировать дальнейшие эксперименты. Пренебрегая процедурой компенсации или оставляя ее «на потом», можно в конце работы обнаружить, что полученные данные не являются сколь-либо значимыми. Настраивать и проверять компенсацию лучше всеми перечисленными выше методами. После настройки и проверки значения компенсации необходимо сохранить, и все (!) эксперименты, которые планируете сравнивать между собой, проводить, не внося изменений.

Пермеабилизация

Для измерения внутриклеточных белков и анализа нуклеиновых кислот (например, для исследования клеточного цикла и пролиферации) клеточную мембрану нужно сделать проницаемой для данного красителя - провести пермеабилизацию при помощи специальных веществ.

Реагенты для пермеабилизации

Глобально реагенты для пермеабилизации деляется на два типа :

  • Органические растворители (метанол, этанол, ацетон), которые одновременно фиксируют и пермеабилизуют мембрану, растворяя липиды и коагулируя белки. (Впрочем, в большинстве случаев стадию фиксации лучше провести отдельно, используя 2–4% раствор параформальдегида.) Как правило, используются в концентрации 70–90%; к основным преимуществам относится возможность длительного хранения клеток на −20 °С, а также лучшее разделение пиков при подборе оптимальных условий
  • Детергенты , которые создают пóры в клеточной мембране, - сапонин (saponin ), Trition-X-100 , Tween-20 и другие. Сапонин используют в случаях, когда необходимо изучать внутриклеточные белки одновременно с поверхностными маркерами. Его действие обратимо, поэтому сапонин должен также содержаться во всех растворах и буферах для окрашивания, применяемых после стадии пермеабилизации. «Тритон X-100» часто добавляют одновременно с красителями, что уменьшает длительность эксперимента. Как именно работают эти детергенты? Сапонин селективно «извлекает» из мембраны молекулы холестерина и за счет этого формирует поры. Triton-X и Tween-20 являются неселективными детергентами и способствуют образованию пор в мембранах за счет связывания и удаления мембранных липидов и белков.

В настоящее время предлагается также большое количество коммерческих реагентов для фиксации и пермеабилизации. Несмотря на то, что такие наборы зачастую позиционируются как ready-to-use, не будет лишним все же сделать сравнение различных доступных вариантов фиксации и пермеабилизации в применении к вашему эксперименту перед выбором оптимального.

  • Chromocyte - ресурс, собирающий разные утилиты для цитометристов
  • Flow cytometry (учебник) - базовые методы и применения проточной цитометрии

    • Благодарности

    Автор статьи благодарит Дениса Баева за ценные комментарии, правки и предложения; Галину Судьину за научное руководство и совместную работу; Игоря Кудрявцева , Анну-Полину Шурыгину и Эллу Старикову за прекрасные лекции и научно-практические задачи по проточной цитометрии; Ивана Галкина , Константина Лямзаева и Дмитрия Кнорре за оборудование и консультации; Константина Рубцова за сервисные работы и ремонт оборудования; Виктора Татарского и Мурада Вагиду за рекомендации и антитела.

    Часть приведенных в этой статье данных получена при поддержке грантов РФФИ 16-34-00531 и 17-04-01491.

    Science ;Еще раз про ГМО ;

  • Трансгенные растения - спасители планеты или бомбы замедленного действия? ;
  • L. HOVE, W. GOOSSENS, V. DUPPEN, R. L. VERWILGHEN. (2008). Reticulocyte count using thiazole orange. A flow cytometry method . Unknown journal title. . 12 , 287-299;
  • Mary Johnson. (2013). Детергенты: Тритон Х-100 Твин-20 и другие . MATER METHODS . ru3 ;

    • Еще по теме статьи: